COVID-19 IgG MAX ELISA | Teste de ELISA IgG para o COVID-19.

O teste de COVID-19 IgG MAX ELISA é um ensaio imunoenzimático indireto para a detecção de anticorpos IgG de COVID-19 em soro ou plasma humano.
No início de janeiro de 2020, um novo coronavírus (2019-nCoV) foi identificado como o agente infeccioso que causa um surto de pneumonia viral em Wuhan, China, onde os primeiros casos tiveram seus sintomas iniciados em dezembro de 2019.
Os coronavírus são vírus de RNA envelopados que são amplamente distribuídos entre humanos, outros mamíferos e aves e causam doenças respiratórias, entéricas, hepáticas e neurológicas. Sabe-se que seis espécies de coronavírus causam doenças humanas. Quatro vírus - 229E, OC43, NL63 e HKU1 - são predominantes e geralmente causam sintomas comuns de resfriado em indivíduos imunocompetentes. As duas outras cepas - coronavírus da síndrome respiratória aguda grave (SARS-COV) e coronavírus da síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS-COV) - são de origem zoonótica e têm sido associadas a doenças por vezes fatais.
Os coronavírus são zoonóticos, o que significa que são transmitidos entre animais e pessoas. Sinais comuns de infecção incluem sintomas respiratórios, febre, tosse, falta de ar e dificuldades respiratórias. Em casos mais graves, a infecção pode causar pneumonia, síndrome respiratória aguda grave, insuficiência renal e até morte.
As recomendações padrão para impedir a propagação da infecção incluem lavagem regular das mãos, cobertura de boca e nariz ao tossir e espirrar, cozinhar bem a carne e os ovos. Evite contato próximo com qualquer pessoa com sintomas de doenças respiratórias, como tosse e espirros

O teste baseia-se na detecção de imunoglobulinas da classe IgG geradas após a infecção por COVID-19. Trata-se de um ELISA indireto, no qual as microplacas são revestidas com antígeno recombinante antígeno Ag7 Nucleoproteína SARS-COV2 ao qual são adicionados o soro do paciente, previamente diluído em cada cavidade. Se houver anticorpos específicos no soro teste, ocorrerá a formação da ligação antígeno-anticorpo. O material não ligado é removido pela lavagem e um anticorpo secundário dirigido contra IgG humano marcado com a enzima peroxidase é adicionado. O material não ligado é novamente removido por lavagens. A presença do complexo antígeno- anticorpos é revelada pela adição do substrato 3,3’, 5,5’ Tetrametilbenzedina (TMB), pelo aparecimento de cor nas cavidades onde a enzima estiver presente, indicando a presença de anticorpos. A reação é interrompida pela solução de parada e a absorbância é medida a 450nm. Densidade óptica maior que o cut off é considerado positivo.



Significado Clínico: O teste será realizado quando existe a suspeita da doença causada pelo COVID-19, Anticorpos da classe IgG serão formados na fase de convalescência, indicando uma infecção prévia que já acometeu o paciente em algum momento de sua vida.

Por favor, leia atentamente as instruções antes de começar o teste. Os resultados dependem diretamente da realização do ensaio conforme as descrições contidas nesse material.

- Os reagentes e a Microplaca, na embalagem original inviolada, são estáveis até a data de validade determinada na etiqueta, se conservados entre +2 e +8 °C.
- As tiras não-utilizadas da Microplaca devem ser mantidas na embalagem original selada com a etiqueta plástica para cobertura contendo o dessecante para a sua proteção contra a umidade e a luz.
- A Solução de Lavagem diluída é estável por uma semana à temperatura ambiente +20 e 24°C.
- Não expor os reagentes à luz solar ou à luz forte durante o armazenamento ou utilização. Manter a Solução Reveladora sempre ao abrigo de luz.
- Nenhum dos itens deve ser congelado.
- Todos os itens devem ser mantidos dentro de suas embalagens primária.
- O produto pode ser transportado em temperatura de até 45° C, por até 3 dias.

O teste COVID-19 IgG MAX ELISA foi desenvolvido com a possibilidade de ser realizado de forma seriada pelo operador. Dessa forma, pode-se testar 93 amostras de uma única vez ou no mínimo 21 amostras
Os soros controles do kit devem ser testados com cada grupo de amostras. Deve-se selecionar o número de cavidades desejadas e cobrir as demais com a etiqueta plástica para cobertura, guardar no envelope laminado e armazenar imediatamente à +2 a +8C.

Os materiais descritos a seguir não estão contidos no kit, mas são necessários para uma boa performance do teste.

• Leitor de placa de ELISA com leitura em 450 nm;
• Estufa de 37ºC;
• Equipamento para lavagem de placa: semi-manual ou automático;
• Ponteiras de 10 ?L a 1000 ?L;
• Água deionizada;
• Pipeta multicanal;
• Tubos de 0,2 mL para absorção;
• Tampa para placa;
• Vidraria para diluição da Solução de Lavagem;
• Tubo de 15 mL.

O produto COVID-19 IgG MAX ELISA é somente para o uso em DIAGNÓSTICO IN VITRO.

ESTE PRODUTO CONTÉM MATERIAIS POTENCIALMENTE INFECCIOSOS.

– O kit contém materiais de origem humana que foram testados e confirmados com resultados negativos para anticorpos anti-HCV, anti-HIV I e II e HBsAg para cada doador. Como os testes diagnósticos não podem oferecer completa segurança de que produtos derivados de material humano não transmitem agentes infecciosos recomenda-se que os reagentes sejam manipulados com cuidado durante o uso e descarte, sendo considerados como material de risco biológico. O descarte final deve ser realizado de acordo com a legislação local.
– A Solução de Parada é uma solução ácida e portanto, corrosiva. Manipular com cuidado e lavar abundantemente com água corrente se houver contato com a pele, olhos e mucosas.
– Armazenar o kit em temperaturas de +2 a +8°C imediatamente após recebê-lo. A data de vencimento é o último dia do mês indicado nos rótulos dos frascos e kit. Não utilizar os reagentes após a data de vencimento estipulada. Evitar exposição a temperaturas excessivas.
– Não expor os reagentes diretamente à luz solar.
– Não utilizar componentes do kit danificados ou contaminados.
– Não congelar nenhum dos reagentes pois poderá causar danos e comprometer os resultados. Utilizar uma ponteira para cada soro para evitar contaminação.
– As amostras e controles devem ser testados ao mesmo tempo para que as condições do teste sejam as mesmas.
– Recolocar as tampas de cada reagentes imediatamente após o uso.
– Cuidado para não tocar a superfície dos orifícios durante a dispensação das amostras e reagentes. Evitar que reagentes e amostras escorram pela parede dos orifícios.
– Antes do uso homogeneizar todos os reagentes, com cuidado, por inversão ou rotação.
– Uma vez iniciado o teste não deixar que as cavidades sequem, principalmente durante as incubações.
– Não misturar componentes de diferentes kits.
– Seguir exatamente as instruções referentes a quantidade de reagente, tempo e temperatura de incubação durante o período de absorção do soro.
– Checar a precisão e exatidão dos equipamentos laboratoriais utilizados durante o procedimento para assegurar resultados reprodutíveis.
– Operadores devem ter treinamento para manipular o kit.
– Maiores informações, consultar as FISPQ dos produtos obtidas pelo atendimento ao cliente.

? Tipo de Amostra:

Soro e/ou plasma.
Para amostras de plasma pode ser utilizado EDTA e heparina de sódio como anticoagulante.

? Estabilidade e armazenamento da amostra:

O soro é estável por até 7 dias estando armazenado entre +2 e +8°C. Para períodos maiores armazenar em – 20oC ou -80°C por até 1 anos. Amostras descongeladas devem ser homogeneizadas antes do uso. Não congelar e descongelar repetidamente o soro. Não usar azida sódica ou glicerol como conservante, pois estes componentes podem interferir ou inibir o sistema enzimático peroxidase.

? Volume ideal utilizado para análise:

10?l.

? Critérios para rejeição da amostra:

Amostras que estejam hemolisadas, lipêmicas ou que apresentam contaminação pela presença de filamentos ou partículas fúngicas ou bacterianas devem ser eliminadas.

? Inativação da amostra:

O soro ou plasma deve ser inativado por 30 minutos à temperatura de 56ºC.


Operações Prévias:

a. Anteriormente à realização do ensaio, estabilizar todos os componentes do produto e amostras à temperatura ambiente (+20 a +25º C) e homogeneizá-los suavemente.
b. Diluição da Solução de Lavagem: Diluir 1 parte da Solução de Lavagem 20X Concentrada em 19 partes de água deionizada (exemplo: 25 mL de Solução de Lavagem 20X Concentrada + 475 mL de água deionizada) e estocá-la em frasco limpo. A solução diluída é estável devidamente fechada à temperatura ambiente (+20 a +25 º C) por 5 dias.
c. Cristais na Solução de Lavagem 20X Concentrada desaparecerão após aquecimento em banho-maria a 37º C.
d. Diluição COVID-19 Conjugado Um frasco contém 500 uL de Conjugado. Diluir como exemplificado pela tabela abaixo.
- Não armazenar o conjugado após a diluição.
e. Deixar que a placa atinja a temperatura ambiente (+20 a +25C) antes de abrir a sua embalagem.
f. Montar o protocolo de identificação e orientação de aplicação das amostras diluídas na placa.

Soluções prontas para uso:

• Solução de Parada
• Solução Reveladora
• Controle Positivo
• Controle Negativo
Instruções de Lavagem

a. Um correto procedimento de lavagem é essencial para a obtenção de um dado analítico certo e preciso.
b. Recomendamos a utilização de uma lavadora de microplacas de ELISA de boa qualidade, mantida no mais alto grau de performance de lavagem. Geralmente, 4 a 5 ciclos de lavagem são suficientes para evitar reações falso-positivas e coloração de fundo.
c. No caso de lavagem manual, é sugerida a realização de 5 ciclos, dispensando 300 µL em cada poço e aspirando o líquido. Repetir 5 vezes.
d. Em qualquer um dos casos, o líquido aspirado deve ser tratado com solução de hipoclorito de sódio a 2% por 24 horas, antes do descarte.


Realização do Ensaio

a. Aplicando a amostra na placa: Diluir a amostra (soro ou plasma) inativada 1/100 no reagente diluente da amostra. Aplicar 100uL por poço. Deve ser utilizado 100 ?l dos soros controles e do Branco (apenas a solução diluente da amostra) por orifício. Homogeneizar cuidadosamente por 5 segundos.
Cobrir os poços com a tampa para placa e incubar a placa por 1 hora a + 37 °C.

b. Aplicando o Conjugado: Lavar cada orifício de 4 a 5 vezes com a Solução de Lavagem diluída1X. Lavagem manual: No final do período de incubação, descartar o conteúdo dos orifícios com um rápido movimento em recipiente de descarte próprio, contendo agente desinfetante. Bater a placa sobre um papel absorvente. Preencher os orifícios com um mínimo de 300 ?l de Tampão de Lavagem por orifício. Despejar o tampão contido na placa no recipiente de material contaminado. Lavar os orifícios vazias 5 vezes. Lavagem automática: programar o equipamento para realização de 5 lavagens, dispensando 300 ?l de Tampão de Lavagem por orifício. O recipiente de descarte acoplado à máquina deve conter desinfetante apropriado. Em ambos os casos, após a lavagem remover o excesso de líquido, batendo repetidas vezes a placa sobre papel absorvente ou papel toalha.
Diluir o Conjugado conforme o item “d” em “Operações prévias”. Distribuir 100 ?L em cada orifício, tampar a placa e incubar por 1h à 37C.

c. Revelação: Lavar a placa 5 vezes com a Solução de Lavagem 1X conforme descrito acima. Distribuir 100?l em cada orifício da Solução Reveladora, misturar suavemente por 5 segundos. Recolocar a tampa e incubar por exatamente10 minutos na ausência de luz à temperatura ambiente (+20 e +25oC).

d. Parada da reação: Após os 10 minutos de incubação, adicionar 100?l em cada orifício de Solução de Parada.

e. Leitura: Realizar a leitura da placa imediatamente após a parada da reação em leitor de placa na faixa de 450 nm. A cor azul mudará para amarelo nas cavidades contendo enzima indicando a presença de anticorpos anti-doença COVID-19. Tempos longos após a parada da reação pode provocar mudanças de densidades de absorbância. O período entre a parada da reação e a leitura não pode exceder 30 minutos.
Nota: As duas etapas de lavagem são extremamente importantes! Lavagens insuficientes podem resultar em falsos positivos. Não indicamos lavagens com pipetas.

O Laboratório Clínico deve possuir um programa interno de controle da qualidade, onde procedimentos, normas, limites e tolerância para variações sejam claramente estabelecidos. É importante ressaltar que todos os sistemas de medição apresentam uma variabilidade analítica característica, que deve ser monitorada pelos próprios laboratórios. Para tanto, é recomendável a utilização de controles, que permitem avaliar a precisão e a exatidão dos analitos.

O valor de cut off foi obtido com base no cálculo de 2 vezes o desvio padrão das amostras verdadeiramente negativas somadas à média. O cut off indica que amostras com densidade óptica no espectro de 450nm acima do valor determinado devem ser consideradas positivas para o ELISA, em contrapartida amostras com densidade de absorbância menor do que valor devem ser consideradas negativasPerformance

• Amostras com contaminação microbiológica, lipêmicas, ictéricas ou hemolisadas podem causar resultados duvidosos, portanto, não devem ser utilizadas.
• Os componentes do produto devem estar límpidos, livres de contaminação microbiológica e dentro do prazo de validade.
• Não devem ser utilizados componentes de diferentes lotes ou reagentes de outros fabricantes. Evitando a contaminação cruzada entre amostras e entre reagentes do produto.
• Para que os resultados sejam reprodutíveis, as instruções fornecidas devem ser rigorosamente seguidas, respeitando os limites de tempo e temperatura das incubações. A pipetagem deve ser precisa.
• Para que não ocorram variações significativas nos tempos de incubação, a pipetagem das amostras não deve exceder a 10 minutos e a adição dos reagentes deve ser efetuada sempre na mesma sequência.
• Falhas nos procedimentos de lavagem podem levar a resultados inválidos.
• A leitora de microplacas mede a absorbância na vertical. Evitar tocar o fundo dos poços.
• A utilização de outras amostras que não sejam soro não são validadas para este teste. Todos os dados clínicos e fatores epidemiológicos devem ser levados em conta na interpretação dos testes.
• Recomenda-se o uso de amostras pareadas em um período de algumas semanas.

• Recomenda-se que o diagnóstico não deve ser baseado em um único ensaio, pois infecções recentes, muitas vezes assintomáticas, podem ainda não ter produzido níveis detectáveis de anticorpos.

Interpretação

• O resultado obtido pela utilizando deste produto tem por finalidade auxiliar ao diagnóstico clínico. Assim este deve ser interpretado associando-se às histórias clínicas dos pacientes, achados clínicos e outros procedimentos de diagnóstico.
• Cada laboratório deve estabelecer seus próprios critérios para interpretação dos resultados, baseando-se na população em estudo.


AVALIAÇÃO DO TESTE: SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE

Distribuição da amostragem utilizada comparando o teste ELISA IgG com o ensaio padrão real time RT-PCR na amostragem no período após de 14 dias do início dos sintomas
Sensibilidade: 91,67%
Especificidade: 100%
Distribuição da amostragem utilizada comparando o teste ELISA IgG com o ensaio padrão real time RT-PCR na amostragem independente do período do início dos sintomas.
Sensibilidade: 66,20%
Especificidade: 100%
Este procedimento é destinado para operadores com experiência neste teste. Siga as instruções detalhadas caso seja a primeira vez realizando este kit.

? Selecione o número de strips desejadas para realizar o teste.

? Diluir a amostra 1/100 na solução Diluente da Amostra (solução de coloração azul). Distribuir 100 ?L por orifício da placa ELISA. Reserve um poço para o Branco. Homogeneizar cuidadosamente por 10 segundos. Cobrir os poços com a folha adesiva e incubar a placa por 1 hora a +37 °C.

? Lave cada orifício de 4 a 5 vezes com a Solução de Lavagem diluída1X. Bata a placa sobre papel absorvente para seguir para a próxima etapa.

? Diluir o Conjugado 1:400 na Solução Diluente da Amostra conforme o número de strips realizadas. Distribuir 100 ?L em cada orifício, tampar a placa e incubar por 1h à 37C.

? Lave cada orifício de 4 a 5 vezes com a Solução de Lavagem diluída1X. Bata a placa sobre papel absorvente para seguir para a próxima etapa.

? Distribuir 100?l em cada orifício da Solução Reveladora, misturar suavemente por 5 segundos. Recolocar a tampa e incubar por 10 min na ausência de luz à temperatura ambiente (20 a 30oC).

? Após os 10 minutos de incubação, adicionar 100?l em cada orifício de Solução de Parada em todos os poços (inclusive no Branco).

? Realizar a leitura da placa imediatamente após a parada da reação em leitor de placa na faixa de 450 nm. A cor azul mudará para amarelo nas cavidades contendo enzima indicando a presença de anticorpos anti-COVID. Tempos longos após a parada da reação pode provocar mudanças de densidades de absorbância. O período entre a parada da reação e a leitura não pode exceder 30 minutos.

Garantia de Qualidade

Antes de serem liberados para o consumo, todos os produtos da Inovatech são testados pelo Laboratório de Controle de Qualidade. A qualidade dos reagentes é assegurada até a data de validade mencionada na embalagem de apresentação, desde que armazenados e transportados nas condições adequadas.
- RESULTADOS DA AVALIAÇÃO DE RISCO RESIDUAL TOTAL:

O Risco do produto foi avaliado e atendeu as determinações descritas pela empresa. Não houveram riscos inaceitáveis e medidas de controle foram tomadas para a minimização de qualquer ameaça.